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質(zhì)粒DNA的大量提取、純化及棉花的遺傳轉(zhuǎn)化
  • 發(fā)布日期:2016-01-22     信息來源:      瀏覽次數(shù):3018
    • 實驗試劑
      1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]
      2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
      3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混勻)
      4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)
      5. 異丙醇
      6. 4 mol/L LiCI
      7. RNase
      8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿
      9. 乙醇
      實驗設(shè)備
      1. 搖床
      2. 制冰機
      3. 高速離心機
      4. 水浴鍋
      5. 超凈工作臺
      6. 玻璃毛細管
      7. 微量注射器
      實驗材料
      棉花,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株
      實驗步驟
      1. 37℃, 250 rpm搖菌500 ml。
      2. 5000 × g離心5 min以收集菌體,用50 ml STE洗滌菌體一次。
      3. 加入溶液I 20 ml懸浮菌體。
      4. 加溶液II40 ml,輕輕將離心管顛倒幾次,置冰浴20 min。
      5. 加預(yù)冷的溶液III30 ml,將離心管顛倒幾次,置冰浴10 min以上。
      6. 10000 × g離心15 mm,取上清液加入0.6倍體積的的異丙醇,充分混勻后室溫放置10 min以上。
      7. 10000 × g離心10 min,棄上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解,加350 ul 4 mol/L LiCI,混勻后室溫放置10 min以上。
      8. 10000 × g離心5 min,取上清液加入RNase至終濃度為100 ug/ml,37℃保溫2h。
      9. 用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍體積的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍體積的無水乙醇。
      10. 離心收集DNA沉淀,70%乙醇洗滌一次。干燥后溶于TE中備用。
      11. 棉花的遺傳轉(zhuǎn)化:大量的質(zhì)粒,用無菌水稀釋成2 mg/ml的DNA溶液進行子房注射。注射在超凈工作臺上進行,注射針是玻璃毛細管,頂端直徑約為0.1mm。將毛細管另一端緊緊套入10-20ul的微量注射器針頭,吸取被注射的DNA樣品6-12ul。注射時,將針頭對準(zhǔn)子房伸出的花絲部分進行。每個子房約注射0.2ulDNA。

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